第六章中药鉴别和检测的主要任务、依据和方法 : 一、 中药鉴别和检测的主要任务
(一)确定中药品种,保证来源真实
如前所述,中药的品种众多,来源复杂,同名异物,同物异名现象严重。而通常确保中药质量的第一关就是确定中药品种,保证其来源符合《中华人民共和国药典》或有关药品标准中所规定的要求。这就是基源鉴别 (原植物、原动物、原矿物鉴别)。通过基源鉴别,确定中药的品种,确定学名,以保证中药来源真实。
(二)检查中药质量,确保用药有效
中药的品种明确后,如果仅符合药品标准规定的品种要求但不符合药用质量要求时,同样不能药用。因此,必须注意检查中药质量。中药的质量主要由有效成分的种类及含量来决定,而这些又受多种因素的影响。因此对每批中药材都需进行其有效成分及其含量的检测。对一些有效成分尚不明了或无准确的含量测定方法的中药,也可以用浸出物测定法,来帮助考察其质量。对于某些药材商品还应进行水分、灰分测定及外来杂物和异性有机物的检查,如对某些有害重金属离子和农药残留量等的检查。随着中药走出国门,和国际市场接轨,今后还将采用药效学、免疫活性以及化学模式识别结合药效学等对中药质量评价的新方法,以确保中药的有效性和安全性。
(三)检测中成药,并不断提高检测水平
中成药中的丸、散、锭、丹、片等剂型,是将有关中药材研成细粉后加工而成,因此,粉末生药 (中药) 的研究技术早已被逐渐广泛运用于中成药的鉴别上。我国近几版的国家药典对中药和中成药都收载了组织粉末的鉴别 (显微鉴别) 项,并在不断扩大品种与数量,如《中华人民共和国药典》1990年版收载中药制剂显微鉴别的中药179种,1995年版增至215种,约占整个制剂的54%。此外,采用显微鉴别的剂型也在逐渐增多,除可用于上述的丸、散、锭、丹、片外,还可用于某些硬胶囊剂、浓缩丸及含有药材细粉的颗粒剂等。目前中成药的显微鉴定还很难检测品种投入的数量,但正在进行显微定量方法的研究,如选用海金沙孢子和蒲黄花粉粒作参比物,对中成药贝羚散中的羚羊角,疏风活络丸中的马饯子及蛇胆川贝散中的川贝母进行显微定量分析。亦有报道利用牛黄解毒片中的大黄具有多而大的草酸钙簇晶这一特征来控制中成药的投料。但这些目前仅是有益的尝试。
中成药的显微鉴别如能配合理化分析则结果更为可靠,如据报道,安宫牛黄丸除显微鉴定外,还用胆酸对照品和盐酸小檗碱、黄芩甙对照品分别进行薄层色谱法试验,同时用麝香酮对照品进行气相色谱法试验。
我国的中成药品种有5000余种,其中丸剂和片剂约占一半。因此将显微鉴别和理化分析技术用于中成药的质量控制是大有作为的。
二、中药的药品标准及鉴别、检测的依据
《中华人民共和国药品管理法》第二十三条明确规定: 药品必须符合国家药品标准或者省、自治区、直辖市药品标准[注]。国务院卫生行政部门颁布的 《中华人民共和国药典》和药品标准为国家药品标准。
所谓药品标准是国家对药品质量规格及检验方法所作的技术规定,是药品生产、供应、使用、检验和管理部门必须共同遵循的法定依据。根据 《国家药品标准工作管理办法》 的规定,凡正式批准生产的药品、辅料和基质以及商品经营的中药材,都要制定标准。
中药饮片的炮制必须符合 《中华人民共和国药典》或者省、自治区、直辖市卫生行政部门制定的 《中药材炮制规范》 的规定; 生产药品所需的原料、辅料以及直接接触药品的容器和包装材料,必须符合药用要求。
《中华人民共和国药典》简称 《中国药典》,是国家药品的法典。它规定了药品的来源、质量要求和检验方法。全国的药品生产、营销、使用、检验和管理部门等各有关单位都必须遵照执行。《中华人民共和国卫生部药品标准》简称 《部颁药品标准》,对在同时期该版药典中尚未收载的品种和内容有所补充,也是国家药品标准,各有关单位亦必须遵照执行。地方药品标准是省、自治区或直辖市卫生厅 (局) 批准执行的药品标准,在该地区的药品生产、营销、使用、检验和管理等单位必须遵照执行,而对其他地区则无约束力,但可作为参照执行的标准,其所载品种和内容上若与国家药典或部颁药品标准有重复和矛盾时,应首先按国家药典执行,其次按部颁药品标准执行。新版药典凡例还明文规定,对本版药典收载的药材及制剂,均应按规定的方法进行检验,如需采用其他方法,应将该方法与规定的方法做比较试验,根据试验结果掌握使用,但在仲裁时仍以新版药典规定的方法为准。
中药鉴别及检测的依据就是中华人民共和国药典或卫生部颁布的有关药品标准 (部颁标准)。如上两者均未有规定的,则依据省、自治区、直辖市制定的药品标准。如为尚无标准的新药,则要根据国家标准的有关要求和项目,制定出新药的药品标准,报国务院卫生行政主管部门,经审查合格批准后,方能作为依据。但由于我国的中草药资源极为丰富,品种繁多,其中多数品种尚没有被国家和地方标准所收载,没有药用的法定依据,此时可参照国内有关专著,中 (草) 药志或学术论文等进行鉴别。
三、药材的取样法
药材取样法是指选取供鉴别和检测用药材样品的方法。取样的代表性直接影响到鉴别和检测的正确性,因此,必须按中国药典的规定,重视取样的各个环节 (详见附录三)。
四、中药材检定通则
中药材的检定包括鉴别和检测。其主要项目有 “性状”、“鉴别”、“检查”、“浸出物测定”、“含量测定”等项目。按《中国药典》的规定,在检定时,应遵守下列有关的各项规定。
1. 取样应按附录Ⅳ所述的 《药材取样法》的规定进行。
2. 为了正确检定药材,必要时可用符合1995年版药典规定的相应药材标本作对照。
3. 供检定的药材如已切碎,除 “性状”项已不完全相同外,其他各项应符合规定。
4. “性状”系指药材的形状、大小、色泽、表面特征、质地、断面 (包括折断面或切折断面) 特征及气味等。
5. “鉴别”系指检定药材真实性的方法,包括经验鉴别、显微鉴别及理化鉴别。
(1)经验鉴别系指用简便易行的传统方法观察颜色变化、浮沉情况以及爆鸣、色焰等特征。
(2)显微鉴别系指用显微镜观察药材切片、粉末或表面等的组织、细胞特征。照药材及成方制剂显微鉴别法 (见附录)项下的方法制片观察。
(3)理化鉴别系指用化学或物理的方法,对药材中所含某些化学成分进行的鉴别试
验。
6. 检查系指对药材的纯度进行测定的方法,包括水分、灰分、杂质等检查。
7. 浸出物测定系指用水或其他溶剂对药材中可溶性物质进行测定的方法。
8. 含量测定系指用化学的、物理的或生物的方法,对药材质量进行检定的方法,包括挥发油及主成分的含量、生物效价测定等。
【注意】 1. 进行测定时,需要粉碎的药材,应按各该项下规定的要求粉碎过筛,并注意混合均匀。
2. 检查和测定的方法按各该药材项下规定的方法或指定的有关附录的方法进行。
五、中药鉴别和检测的一般方法
(一) 中药鉴别的一般方法
中药鉴别的方法很多,概括起来,可分为基源 (原植物、动物和矿物) 鉴别、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别四种方法,即通常所说的四大鉴别法。各种方法均有它的特点和适用对象,且往往需要几种方法配合进行,得出的结论才更为正确。
1. 基源鉴别: 又称来源鉴别,主要是用植物、动物分类学和矿物学的有关知识和方法,对中药进行鉴别,搞清品种来源,定出学名。基源鉴别的程序一般为:
(1) 观察药材标本: 对较完整的药材标本,应注意观察其各部分的形态,特别是具鉴别特征的形态,如植物的繁殖器官 (花、果、孢子囊、子实体等) 更要仔细观察,必要时可借助于扩大镜和解剖显微镜来观察,并作好记录。
(2)核对有关文献: 根据已观察到的标本特征和检品的产地、别名、功效等,查阅和核对全国性或地方性的中药材专著、图鉴或手册等工具书,必要时可核对原始文献,搞清其科属或类别来源。
(3) 核对标本室标本: 当知道其科属后,可到标本室核对已定学名的该科属或类别的标本,或根据文献核对已定学名的某种标本。核对标本应到具有权威性的有关标本馆(室)进行,如国家级、省级、著名高等院校、科研院所的植物、动物和矿物标本馆(室)。必要时可请教全国或省内有关的知名专家。
基源鉴别是中药鉴别的第一步,是基础。
2. 性状鉴别: 又叫经验鉴别、外观鉴别。这是一种传统的鉴别方法,几千年来鉴别中药都是用“眼看、口尝、手摸、鼻闻”或水泡、火烧等简便易行的方法,非常适用,直至现在,这仍是鉴定中药普遍使用的一种方法。现在,利用植、动物形态,解剖学及矿物学的有关知识与传统鉴别经验相结合,以提高鉴别的准确性和科学性。
性状鉴别的内容,一般包括以下十个方面:
(1)形状: 药材的形状与药用部位有关,每种药材的形状一般比较固定。如根类、根茎类、皮类、叶类、花类、果实类、种子类等,因它是植物的某个器官,故都有一定的外形特征,在此基础上,再找出个别药材的特点,这样就容易鉴别和记忆。此外,老药工有些经验鉴别术语,形象生动,易懂易记,应予重视。如野生人参为“芦长碗密枣核艼、紧皮细纹珍珠须”、三七为“铜皮、铁骨、狮子头”、海马为“马头蛇尾瓦楞身”等。
对于干燥、皱缩的花、叶、全草等类药材,在观察外形前,应先用温水浸泡,待其展平时再仔细观看。
(2) 大小: 药材的大小系指长短、粗细、厚薄。如测量的大小与规定有差异时,应测量较多的样品,可允许有少量高于或低于规定的数值。测量时可用毫米刻度尺,对于细小的种子,可放在有毫米方格线的纸上,在扩大镜下测量。表示药材的大小一般应有一定的幅度。
(3)颜色: 各种药材的颜色虽不尽相同,但均有一定的颜色,这与该药材的品种和炮制方法有关。有时因加工、贮藏不当,亦会改变其固有的色泽。药材的颜色是衡量药材质量好坏的重要因素之一。很多药材的颜色不是单一的,而是复合的色调。如有两种以上色调复合描述时,应以后一种色调为主,如黄棕色,即以棕色为主。观察色泽时,一般应在白昼光下进行。
(4)表面特征: 指药材表面所具有的特征,如光滑或粗糙,有无皱纹、毛茸、刺等。双子叶植物根类药材顶部有的带有根茎;单子叶植物根茎类药材常有膜质鳞叶; 蕨类植物根茎多有叶柄残基和鳞片。药材的表面特征常常是鉴别药材的重要依据之一。
(5)质地: 系指药材软硬、坚韧、疏松、致密、粘性、粉性、纤维性等。这与药材的加工方法也有关,如含淀粉多的药材,经蒸煮则淀粉糊化,干燥后质地坚实; 盐制品如盐附子易吸潮变软; 富含淀粉的,质地粉性; 富含挥发油而润泽的,质地油润等。
(6)折断面: 指药材折断时的现象,如易折断或不易折断,有无粉尘 (淀粉),折断面特征等。折断面的特征反映药材组织构造的特点。自然折断的断面应注意其断面是否平坦,或显纤维性、裂片状、颗粒性或可层层剥离,有无胶丝等。折断面特征是鉴别中药的重要依据之一,并有很多术语,如茅苍术“起霜”(断面析出白毛状结晶——苍术醇)、牛膝的“筋脉小点”(同心性异型维管束)、何首乌的“云锦花纹” (复合性异型维管束)、大黄的“星点”、“锦纹” (异型维管束和射线),还有黄芪的“菊花心”、粉防己的 “车轮纹”、苍术的“硃砂点”等等。对于不易折断或断面很不平坦的药材,可用刀切成横切面,以观察断面的特征。
(7)气:有些药材有特殊的气味,这是由于其含有挥发性物质的缘故。这也是鉴别中药的主要依据之一。如薄荷、紫苏的香气,阿魏特异的蒜臭气以及云木香、甘松、藿香、麝香、肉桂、当归、独活等特殊的气味。对于气味不很明显的药材,可切碎后或用热水浸泡后再闻。
(8) 味: 每种药材的味感是比较固定的。有些药材的味感是衡量品质的标准之一。如甘草、党参以味甜为好,黄连、鸦胆子以味苦为好,乌梅、山楂以味酸为好,何首乌、五倍子以味涩为好。这均与其所含化学成分及其含量有关。口尝药材时要注意取样的代表性,如果皮与种子,根、根茎、树皮的外侧和内侧。同时对剧毒或刺激性强的药材要特别小心,如草乌、半夏、天南星等,取量要小,尝后立即吐出,并漱口和洗手或嚼食甘草等,以免中毒。
(9)水试: 有些药材在水中或遇水能产生特殊的现象,而作为重要鉴别特征。如秦皮的水浸液在日光下显碧兰色荧光; 番红花的水浸液黄色; 车前子、葶苈子遇水则体积膨胀、种皮粘滑; 熊胆粉末投入清水杯中,即在水面旋转并呈现黄线下沉而不扩散。这均与其所含化学成分有关。水试对某些药材是行之有效的鉴别方法。
(10) 火试: 有些药材用火烧,能产生特殊的气味、颜色、烟雾、闪光和响声等,可作鉴别的特征。如海金砂易点燃而爆鸣、闪光; 麝香少许火烧有轻微爆鸣声,起油点如珠,似烧毛发但无臭气,灰为白色; 乳香燃烧微有香气,但不应有松香气,不冒黑烟,最后留有黑色残渣。
以上的鉴别方法对中药饮片亦适用,特别是横断面、气、味、水试、火烧等,中药饮片的外形和表面特征常被破坏,但只要注意观察和比较,中药饮片的鉴别也是容易掌握的。
3. 显微鉴别: 显微鉴别又称为组织粉末鉴别。它是利用植物或动物细胞学、解剖学及矿物学的有关知识和方法,在显微镜下找出中药的结构特征、细胞或结晶形状及各种内含物,作为鉴别的依据。此方法较难掌握,目前多用于鉴别难于鉴别的中药和粉末性中药及中成药。
进行显微鉴定时可根据样品的完整性,尽量选用具有代表性的样品,制作不同的显微制片。一般需作横切片或粉末制片。鉴别叶、花或其他器官的表面特征时,可制作表面片。为观察某些细胞组织,还可制作纵切片或组织解离片。中成药的丸、散、冲剂等剂型则按粉末特征进行鉴别。
显微鉴别常用的制片方法,如徒手切片法、表面片制片法、粉末制片法、组织解离法等详见本书附录 “几种常用的检测方法”“制片方法的简介”项下。
在进行显微鉴别时,须认真观察各类组织的结构特点以及细胞、内含物的形状特征。细胞和后含物的直径、长短,也是显微鉴别中药的重要依据之一,特别是中成药的鉴别。中成药的剂型很多,能进行显微鉴定的成方制剂主要有散剂、丸剂、片 (锭) 剂、丹剂,其次是投入有药材细粉的浸膏剂、浓缩丸剂、颗粒剂和冲剂等。因为它们含有药材的细胞、组织碎片、后含物和其他细微特征。
中成药显微鉴别时,一般须根据处方,明确品种和药用部位,对各组成药材粉末特征分析比较,排除共性的特征,选取各药在该成药中较具专属性的显微特征,作为鉴别依据。
中成药显微鉴别的制片,一般同单味药粉末。不同的是对所用剂型制片的处理。中成药的显微制片方法见附录。
矿物药的显微鉴定除直接粉碎成细粉观察外,还可进行磨片观察。如对透明矿物可磨成薄片在偏光显微镜下,根据光透射到矿物晶体内部所发生的折射、反射、干涉等现象进行鉴定; 对不透明矿物可磨成光片,在矿相显微镜下,根据光在磨片上反射时所产生的现象,观察测定其反射力、反射色、偏光图等进行鉴别。此外,还可利用电子显微镜、电子探针、X射线衍射分析、差热分析、光谱分析等现代分析方法。如青礞石,过去误认为其来源是绿泥石片岩,近年来经运用偏光显微镜和红外光谱等现代分析方法已检清青礞石的商品种类,绿泥石片岩在药用青礞石中并不存在。而当前所用青礞石是以黑云母片岩为主,其次尚有绿泥石化云母碳酸盐片岩。
在进行中成药粉末鉴别时,须详细记载具有特征性的细胞、组织及细胞内含物的形状及性质,以及矿物晶体、碎片的特征,测量其大小,并绘图。辅以必要的显微化学反应,以确定细胞壁、细胞内含物及结晶、碎片的性质。
近年来随着现代科技的发展,中药材显微鉴别的手段和方法也有很大的发展,透射电镜、扫描电镜、扫描电镜+X射线能谱分析等新设备和技术均已用于药材的显微鉴别上。其中运用较广的是扫描电子显微镜,它能使物质的图像呈现表面立体结构,放大倍数可在10倍至200000倍之间连续调动。且样品制备简单,不需超薄切片,有的粉末和新鲜材料可直接送入观察,样品最大尺寸为直径2.5cm,高2cm。对难以区别的同属多种药材的表面细微特征,如种皮和果皮的纹饰,花粉粒,茎、叶表皮组织如毛、腺体、分泌物、气孔、角质层、蜡质等的结构以及管胞、导管、纤维、石细胞、后含物、晶体等。有的动物药材的体壁、鳞片及毛等均具重要鉴别价值。扫描电镜+X射线能谱分析技术近年来已越来越多地用于药材的分析上。
4. 理化鉴别: 运用中药化学知识和有关物理学知识,包括使用各种简便的分析仪器来鉴别中药的真伪。较常用的方法有:
(1) 化学定性反应: 利用中药中的某种成分能与有的化学试剂发生特殊的颜色、沉淀、结晶或气味等反应来进行鉴别,一般在试管或比色板中进行。目前此种方法多为某类化合物共有的反应,而专属性较差。
(2) 显微化学反应: 性质和原理同上,但结果需在显微镜下观察。是将中药的干粉、手切片或浸出液少量,置于载玻片上,滴加某些化学试剂,使产生沉淀或结晶,或产生特殊的颜色,置于显微镜下观察。如黄连粉末滴加稀盐酸,可见针簇状小蘖碱盐酸盐结晶析出; 槟榔粉末0.5g加水3～4ml及稀盐酸1滴,微热数分钟,取滤液于玻片上,加碘化铋钾试液1滴,即发生混浊,放置后取1～2滴于载玻片下,加盖玻片于显微镜下观察,可见石榴红色球形或方形的槟榔碱结晶。
(3)微量升华: 是利用中药中含有升华成分,根据升华物的结晶形状、性质、色泽和加试剂后的变化,在显微镜下进行观察并记录其反应来进行鉴别,如大黄粉末的升华物在低温时为黄色针晶,高温时则为片状或羽状结晶,在其上加碱液则呈红色。微量升华的方法详见本书附录。
(4) 荧光反应: 是利用中药的某些成分能在常光或紫外光下产生荧光的性质来进行鉴别。通常可直接取中药材片块、粉末或浸出物在紫外光下进行荧光分析。如黄连折断面在紫外光灯下其小檗碱成分显金黄色荧光,木质部尤为显著。秦皮的水浸出液在常光下显淡蓝色荧光。有的药材本身不产生荧光,但以某种试剂处理后可使有的成分产生荧光,如芦荟水溶液加硼砂共热则产生绿色荧光。
(5)蛋白电泳法: 中药材中特别是动物类和种子、果实类常含有蛋白质和氨基酸。近年来用聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳法鉴别含蛋白质、氨基酸的中药材,操作简便、重现性好,电泳谱稳定可靠。据报道,已做蛋白电泳的中药材有蛤蟆油、蟾酥、地龙等20余种动物药和紫苏子等20余种果实种子类药材,并有望利用分析种子蛋白来解决植物种的分类问题。
(二)中药的检 (查)测
为确保中药质量,还需根据中药种类,选做以下有关项目的检查或检测:
1.物理常数的测定: 包括相对密度、旋光度、折光率、硬度、粘稠度、沸点、凝固点、熔点等的测定。这对挥发油 (如薄荷油等)、油脂类 (如蓖麻油等)、树脂类 (如乳香等)、液体类 (如蜂蜜等) 和加工品类 (如阿胶等) 药材的真实性和纯度的鉴定具有很重要的意义。如药材中掺有其他物质时,其物理常数就会随之改变,如蜂蜜中掺水就会使比重降低,而影响粘稠度。对油、脂、腊等还需进行测定物理常数和化学常数,如羟值、酸值、皂化值和碘值等,以表示其品种优劣渡。
2. 膨胀度的测定: 有些药材中含有粘液、果胶、树脂等成分,有吸水膨胀的性质,如葶苈子、车前子、亚麻子等果实种子类药材,其种皮含有丰富的粘液质,吸水膨胀的程度和其所含的粘液成正比关系。这一性质可用于药材的检测,如中国药典规定,北葶苈子膨胀度不得低于12,南葶苈子不得低于3。蛤蟆油的膨胀度不得低于55。
3. 色度检查: 含挥发油类成分的中药,在贮藏的过程中常易发生氧化、聚合等化学变化而致变质、变色,习称为 “走油”。《中华人民共和国药典》规定检查白术的色度就是利用比色鉴定法,检查有色杂质的限量,以了解和控制药材变质走油的程度。
4. 泡沫指数检查: 中药材含皂素类成分则可用泡沫指数作为质量指标。因为皂素的水溶液振摇后能产生持久的泡沫,利用此性质可作为鉴别含皂素类中药的指标。如 《中华人民共和国药典》对三七、远志等的鉴别均利用了泡沫反应。
5. 水分测定: 中国药典对某些中药材的水分含量限度有明确的规定,如牛黄不得超过9%,红花不得超过13%,阿胶不得超过15%等。这是因为如药材中的水分含量过高,就会促使其霉烂变质和有效成分分解而降低疗效。根据药典规定,测定中药水分的方法有烘干法、甲苯法和减压干燥法等三种。详见本书附录。
6. 灰分测定: 中药的灰分是包括中药本身经过灰化后遗留的不挥发性无机盐类,以及中药表面附着的不挥发性无机盐类,即总灰分。测定中药灰分的目的是限制药材中泥沙等杂质,因为各种中药的总灰分应在一定的范围之内,如果在加工和运输等环节中有其他无机物质如泥土、沙石等的污染或掺杂,则其总灰分将高于或大大高于其正常范围。《中华人民共和国药典》规定了中药总灰分的最高限量,如阿胶不得超过1%,阿魏不得超过7%,安息香不得超过0.5%等,这对保证中药的纯度有重要意义。
在灰分测定中,还有酸不溶性灰分和硫酸化灰分的测定。如中药大黄的组织中含有大量草酸钙簇晶,因而其总灰分就高,此时,就应测其酸不溶性灰分,即加10%盐酸处理,而得到不溶于10%盐酸的灰分,即溶去了总灰分中的钙盐,而残留的都是泥土、砂石等硅酸盐,从而能较精确地反映药材的质量。所谓硫酸化灰分是样品在灼烧前加一定浓度的硫酸适量处理,然后升温至600℃,灼烧灰化后所测得的数据。灰分的测定方法见附录。
7. 浸出物的测定: 对于某些有效成分尚不清楚或有效成分尚无精确定量方法的中药,通常可根据已知成分的溶解性质,进行浸出物的测定,这也是最常用的确定质量指标的方法。中药的有效成分通常在水和不同浓度的乙醇中,在一定的条件下其浸出物的含量大致有一定的范围。因此以浸出物的含量控制中药质量具有实际意义。常用的溶剂是水和不同浓度的乙醇,少有用乙醚和氯仿的。《中华人民共和国药典》规定,枇杷叶的水溶性浸出物不得少于10.0%; 板蓝根的45%乙醇浸出物不得少于8.0%; 独活的乙醚浸出物不得少于25.0%。浸出物测定的方法见附录。
8. 杂质检查法: 所谓杂质是指①来源虽与规定相同,但其性状或部位与规定不符;②来源与规定不同的物质; ③无机杂质,如砂石、泥块、尘土等。如《中华人民共和国药典》规定番泻叶杂质不得超过6.0%。其检查方法详见附录。
9. 灰屑检查法: 检查中药饮片中灰屑的含量,即清洁度检查。其方法详见附录。
10. 有害物质的检查: 有害物质是指中药中的对人体有害、有毒的无机、有机成分,主要是指有机氯、有机磷农药残留量、黄曲霉毒素及铅、砷等重金属含量的检查。中药的有效和无害是同等重要的,中药要进入国际市场则其有害物质的含量一定要低于国际的有关规定。
(1) 有机氯和有机磷农药残留量的测定: 因有机氯类农药中的二二三 (DDT) 和六六六 (BHC) 是使用最久、数量最大的农药。此外有机磷农药如敌百虫等,使用亦很广泛。由于它们在使用后会在土壤里或生物体中长期残留和积累而危害人体,因此世界各国都非常重视食品和药物中有机氯、有机磷农药残留量的检测和限量问题。
(2) 黄曲霉毒素的检查: 由于黄曲霉毒素的危害极大,世界各国对食品和药品中黄曲霉的限量作了严格的限定。目前,黄曲霉污染中药的研究报道较多。
(3) 重金属的检查: 重金属是指在实验条件下能与硫代乙酰胺或硫化钠作用显色的金属杂质。如铅等。《中华人民共和国药典》 中收载重金属、砷盐限量及其他金属盐检查的中药主要是矿物类中药,如石膏含重金属不得超过百万分之十,含砷盐不得超过百万分之二。并对植、动物类中药材中重金属检查作出了明确规定,如地龙重金属不得超过百万分之三十; 薄荷油重金属不得超过百万分之十; 阿胶重金属不得超过百万分之三十,含砷盐不得超过百万分之三。重金属、砷盐等的检测方法见附录。
(三)中药有效成分定性、定量分析
如前所述,中药的疗效主要取决于其有效成分的种类及含量,因而以其作为指标所进行的检测对保证中药质量的好坏至关重要。中药有效成分的定性、定量分析主要有:
1. 有效成分的定性分析: 详见附录中 “有效成分的理化鉴别法”。
2. 有效成分的定量分析: 主要方法有:
(1) 重量法: 是分析化学的基础分析方法,无须基准物质对照,其结果较为可靠,但操作繁琐费时。
(2) 中和法: 又称酸碱中和法,是利用酸碱中和反应的容量分析方法,应用广泛。(3) 非水溶液滴定法: 是在非水溶剂中进行滴定的方法,使有些在水溶液中进行不完全的反应,在非水溶液中能进行完全。
(4) 络合量法: 是利用络合反应来进行定量的容量分析方法,常用的有银氨络离子法、汞量法及氨羧络合剂法。
(5)银量法: 是根据滴定液与待测物能生成难溶物的沉淀反应来进行定量的一种定量分析方法,亦是容量沉淀法的一种。
(6) 氧化还原法: 是以氧化还原反应为基础的一种容量分析方法,应用较为广泛。(7) 重氮化滴定法: 是利用NaNO2克分子溶液在酸性环境下进行重氮化反应测定芳香族伯胺化合物含量的方法。
(8) 挥发油测定法: 挥发油的含量是衡量药材质量好坏的主要依据之一。《中华人民共和国药典》对有关药材挥发油的含量均作了明确规定,如薄荷挥发油含量不得低于0.8% (ml/g); 原豆蔻仁不得低于5.0% (ml/g)、印尼白蔻仁不得低于4.0% (ml/g);阳春砂、绿壳砂种子团不得低于3.0% (ml/g)、海南砂种子团不得低于1.0% (ml/g)。挥发油的具体测定方法详见附录。
(10) 色谱法: 又称层析法,是将中药进行化学成分分离和鉴别的重要方法。其基本原理是利用不同物质在不同的两相中所表现的物理化学性质上的差异,当一相固定,另一项流动时,这些物质在两相中就要反复进行物理、化学运动,使得那些在物理、化学性质上只有微小差异的组分也能产生差速移行,从而使不同组分得到充分的分离。按层析方法不同可分为多种,最常用的有以下3种。
薄层色谱法: 是将吸附剂或载体涂布于大小适宜的玻璃板上,使成一均匀的薄层,层析过程在薄层板上进行。此方法既可定性,又可定量。定性时,一般选用已知主成分的化学纯品或标准中药样品的相同提取物为对照品,经薄层展开后,用一定方法显色,样品应与对照品有相同对应斑点。亦可选择适当条件用扫描法绘成薄层扫描图谱,供定性鉴别。定量时,除可将薄层上主成分斑点刮取,经溶剂洗脱后进行测定外,也可在薄层板上直接测定含量。当前使用较多的是薄层扫描法。此方法是用一定波长的光,照射在薄层斑点上,对有吸收或能产生荧光的成分,能产生一定强度的吸收或荧光,用反射法或透射法进行扫描测定。常用的仪器是薄层扫描仪,方法快速,灵敏度高。
气相色谱法: 此方法的流动相是气体,称为 “载气”。色谱柱内装吸附剂,高分子多孔小球或涂有固定液的载体。注入进样口的供试品被加热气化,被载气带入色谱柱内分离后,各成分先后进入检测器,用记录仪记录色谱图,根据组分的量与峰面积或峰高成正比的关系进行定性、定量分析。此方法可以分析气体及有一定挥发性的液体和固体样品。中药和中成药中常含挥发油及其他挥发性组分,最适用于气相色谱法进行分析。
高效液相色谱法: 此方法的流动相是具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲剂等。先用泵将流动相压入装有填充剂的色谱柱,注入供试品,经流动相带入柱内,在填充剂上分离后,各成分先后进入检测器,用记录仪记录色谱图。本法只要求样品能制成溶液而不需要气化。本法对于挥发性低,热稳定性差,分子量大的高分子化合物以及离子型化合物尤为适宜,如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、类脂、维生素及无机盐类等。
有关层析法的具体方法详见附录。
(11) 分光光度法: 是通过测定物质在特定波长处或一定波长范围内的吸收度,对该物质进行定性和定量的分析方法。一般常用的波长为: 紫外光区 (200～400nm),可见光区 (400～850nm),红外光区 (2.5～15μm; 或按波数计为4000cm-1～667cm-1)。所用的仪器为紫外分光光度计,可见分光光度计 (或比色计)、红外分光光度计和原子吸收分光光度计。
紫外分光光度法: 适用于主成分或有效成分在200～400nm处有最大吸收波长的中药。在测定样品时,要先检查所用溶剂在所测定波长附近应无吸收,不得有干扰吸收峰。测定时一般应以配制样品的同批溶剂为空白。所配样品溶液的吸收度读数以在0.3～0.7之间的误差较小。这一方法不仅能测定有色物质,对有共轭双键等结构的无色物质也能精确测定,它具有灵敏、简便、准确,既可作定性分析又可作含量测定的优点。但由于它测定的样品大多为非单体化合物,所以在测定中药时应配合性状、显微和其他理化鉴定方法,则结果更为可靠。
红外分光光度法: 本法主要用于物质的鉴别和分析结构。红外光谱又称振转光谱,特征性很强,特别是在指纹区 (7～15μm一段),吸收峰很多,而且尖锐。由于光谱的专属性强,几乎没有两种单体的红外光谱完全一致,因此,本法对中药成分的定性鉴别结果准确。通常红外光谱鉴别,需要标准品或标准图谱进行对照,测定的物质常需纯品。但近年来中药粗提物用红外光谱进行品种鉴别的成功报道已越来越多。
原子吸收分光光度法: 此法是基于从光源辐射出的待测元素特征光波通过供试品蒸气时,被蒸气中待测元素的基态原子所吸收,测定辐射光强度减弱的程度以求出供试品中待测元素含量的一种方法。比较标准品和供试品的吸收度,即可求得样品中待测元素的含量。本法具有专属性强、检测灵敏度和精度高,测定快速等特点,是目前用于测定中药和中药制剂中微量元素的最常用的方法。所用仪器为原子吸收分光光度仪。
(12) 色谱光谱联仪分析法: 各种色谱仪器和光谱仪器均在迅速发展,它们各有自己的优点和弱点,为做到分离检测手段更加快速、灵敏、准确,样品需要量少,仪器种类简化,所以需要有关仪器联机,用微机分析来达到取长补短、协同发挥功效的更新仪器。如气层-质谱 (GC-MS)、红外-质谱 (Ir-MS)、高效液相-质谱 (HPLC-MS)、质谱-质谱 (MS-MS) 等。国外称“质谱-质谱” 为 “串联质谱”,分析时不需要对中药进行提取分离,可直接以粉末进样,所以很适用于粉末药材。
国内使用较多的是气质联仪,即气相色谱-质谱分析,再加上计算机联用。它充分发挥了气相色谱的高分离效能和质谱的高鉴别能力的特点,所得数据用电子计算机解析运算,结果准确、快速,已得到广泛应用。如对辛夷、细辛、牡荆叶、地鳖虫、红娘子等挥发性成分的分析,一般都能分析出十余种至数十余种单一成分及其含量。据报道,对9种辛夷的挥发油成分分析,共鉴定出69种化合物,分别测出了它们的含量,如樟脑在望春玉兰 (Magnolia biondii) 中含44.20%,凹叶木兰 (M. sargentiana) 中含40.00%,而在其他种中则含量甚微。这些研究成果,为中药的品质评价提供了重要的依据。